海洋微生物與自動化——探索深海領(lǐng)域的另一種可能

生命起源于海洋，地球上的氧氣約有一半由海洋光合作用所產(chǎn)生，而葉綠素是光合作用光能捕捉與化學(xué)能產(chǎn)生所需的關(guān)鍵分子，光合生命進(jìn)化出復(fù)雜的捕光機(jī)制。

海洋真核藻類在大小、顏色和形態(tài)上各不相同，但它們的捕光色素-蛋白復(fù)合體中大多采用了一種陸地植物所缺乏的、名為葉綠素c的分子。葉綠素c是一類在海洋浮游生物中廣泛存在的葉綠素，它的吸收光譜主要集中在藍(lán)綠色光區(qū)域，能夠吸收波長較短的光線，因此在海洋中發(fā)揮了重要的作用。

2023年11月24-28日，青島召開的全國海洋微生物學(xué)學(xué)術(shù)研討會上，來自西湖大學(xué)的李小波團(tuán)隊(duì)發(fā)表了他在藻類光合作用的代謝合成酶（包括葉綠素、類胡蘿卜素），以及在缺氮等逆境條件下，這些色素含量和組成的變化。

▲藻華漩渦。2021年南大西洋的浮游植物藻華漩渦 (綠色和淺藍(lán)色)。

早在2023年10月，李小波團(tuán)隊(duì)就在Science發(fā)表題為“A chlorophyll c synthase widely co-opted by phytoplankton"（一種被浮游植物廣泛選擇的葉綠素c合成酶）的文章，揭示了葉綠素c合成酶編碼基因及該酶作用機(jī)制，挖掘了葉綠素c的生理功能，討論了該基因的演化形成與轉(zhuǎn)移。

▲從藻類中提取的各類色素（作者：李小波教授研究團(tuán)隊(duì)）

綠藻在缺氮脅迫下的光合適應(yīng) /

萊茵衣藻

萊茵衣藻，是一種單細(xì)胞藻類，在缺氮條件下，氮轉(zhuǎn)運(yùn)能力上調(diào)，甘油三酯等脂質(zhì)積累，可以作為生物能源的前體，為了持續(xù)產(chǎn)生甘油三酯，需要有持續(xù)的光合作用，但是缺氮會導(dǎo)致黃化，葉綠素降低及能量猝滅。了解這其中的機(jī)制后，就可以讓藻類在逆境條件下繼續(xù)光合作用，把能量保持在特定的產(chǎn)物中，來保持產(chǎn)量。

為了尋找這個過程中的基因，因?yàn)槭菃伪扼w，通過隨機(jī)插入突變，不需要自交就可以看表型，將抗性基因的DNA轉(zhuǎn)入到萊茵衣藻，在抗性培養(yǎng)基上做篩選，產(chǎn)生76000個突變體。

PIXL&ROTOR+ /

自動化

人工進(jìn)行篩選肯定不現(xiàn)實(shí)，為了提高效率，采用自動化的方式來識別和篩選菌落，并進(jìn)行隨機(jī)挑取菌落，將其接種成384陣列，為了維持這個文庫，使用384針在瓊脂之間復(fù)制，可以保存文庫，也可以將文庫復(fù)制到篩選平板上，看表型變化，記錄突變體陣列的大小、顏色、熒光等表型。

▲ROTOR＋高通量菌落篩選可短時間內(nèi)操作酵母、真菌、細(xì)菌、微藻的高密度陣列，使用無菌復(fù)制針板，進(jìn)行84、384、1536、6144密度的高通量篩選，不同密度的文庫保存等，PILX自動挑菌設(shè)備采用Pinpoint挑取技術(shù)，通過超聲波自動探測瓊脂高度，對每次挑菌進(jìn)行瓊脂表面壓力探測挑取隨機(jī)菌落。

實(shí)驗(yàn)篩選了384密度菌落陣列，大約有七萬多個突變，可以覆蓋微藻一萬多個基因和絕大多數(shù)非必須基因，獲得大約500個突變體有表型特異性，用于后期研究。

結(jié)果顯示有的黃化慢一點(diǎn)，一直保持綠色，有的黃化快一點(diǎn)，還有能量猝滅，很多突變體無法在缺氮的培養(yǎng)基上生存，有些持續(xù)保持綠色的細(xì)胞，可能黃化對細(xì)胞的生存有保護(hù)作用，從突變體中鑒定了很多基因，一部分跟電子傳遞鏈相關(guān)，也有只知道是個激酶，但作用途徑不清楚。