ROTOR自動化技術(shù)——快速構(gòu)建高通量酵母文庫

釀酒酵母突變文庫是系統(tǒng)生物學(xué)研究的理想模型。因此酵母菌文庫有非常重要的意義，但由于其含有標(biāo)記標(biāo)簽和調(diào)和因子的比較罕見，要構(gòu)建是非常昂貴和費力的。

—Nat Methods. 2016 Apr; 13(4): 371–378.

事實證明，系統(tǒng)性文庫對酵母菌內(nèi)的全基因組研究有重大的意義—實例包括酵母基因敲除文庫和酵母GFP文庫。每個文庫都能讓人們對酵母生物學(xué)的各個方面進(jìn)行全新的認(rèn)識，然而，建立酵母文庫需要付出巨大的努力，這常常掩蓋了酵母文庫本身的價值。無休止的轉(zhuǎn)化、挑取、克隆和驗證工作，成本巨大，工作流程冗長，使科學(xué)家對解決其他新的生物學(xué)問題望而卻步。
 

海德堡大學(xué)Michael Knop實驗室的Anton Khmelinskii和Matthias Meurer開發(fā)了一種無縫基因標(biāo)記方法，以減輕文庫構(gòu)建過程中面臨的問題。他們與以色列魏茨曼科學(xué)研究院的Maya Schuldiner實驗室的IdoYofe和Uri Weill一起，將這種方法進(jìn)一步發(fā)展為SWAp-Tag法。利用ROTOR，此方法可以在短短三周內(nèi)快速構(gòu)建文庫。

文章來源：(2016) One Library to make them all: Streamlining yeast library creation by a SWAp-Tag (SWAT) strategy. Nature methods 13: 371-378

作者：Yofe, I., Weill, U., Meurer, M., Chuartzman, S., Zalckvar. E., Goldman, O., Ben-Dor, S., Schütze, C., Wiedermann, N., Knop, M., Khmelinskii, A. and Schuldiner, M.

SWAp-Tag (SWAT)技術(shù)

SWAp-Tag（SWAT）法依賴于初始受體庫的生成。該受體庫充當(dāng)模板，可以以“即插即用”的方式交換到其他文庫中。

該文庫的構(gòu)建方法很有特色，因為它需要一個一次性傳統(tǒng)方法構(gòu)建的受體菌株文庫，受體模塊插入到已知的基因組位置。通過將受體文庫與含有表達(dá)所需要模塊的供體株配對，可以用新的標(biāo)記、啟動子或其他所需的基因組序列替換該受體模塊。這樣可以輕松，準(zhǔn)確且經(jīng)濟(jì)高效地創(chuàng)建無數(shù)個新的文庫。

SWAT法可以快速直接地生成系統(tǒng)文庫：

（a）整合SWAT受體模塊在N'末端標(biāo)記蛋白質(zhì)。

（b）利用ROTOR讓受體菌株與供體菌株雜交來生成新文庫。再用ROTOR來選擇單倍體孢子并誘導(dǎo)I-SceI表達(dá)。

（c）潛在的供體質(zhì)粒（頂部），可用于創(chuàng)建基因標(biāo)記文庫（底部）
 

SWAT技術(shù)的特點：快速、靈活、免費

Schuldiner和Knop實驗室創(chuàng)建了一種創(chuàng)新的、極其快速的文庫構(gòu)建方法，它可以通過合成不同模塊，輕松生成文庫，而不是從頭開始為每個模塊創(chuàng)建新的文庫。在獲得或構(gòu)建一個受體文庫后，一個新的文庫可以在短短三周內(nèi)生成，并可以立即用于全基因組研究。Schuldiner實驗室已經(jīng)創(chuàng)建了一個原始的受體N' -SWAT文庫，該文庫的N端標(biāo)記為組成性表達(dá)的GFP。此外，此外，使用SWAT法從原始受體庫中又獲得了另外兩個文庫：N’mCherry-tag庫和N’ GFP庫。現(xiàn)在可以從Maya Schuldiner教授已發(fā)表的SWAT文庫中免費獲得GFP-tag、mCherry-tag或GFP熒光文庫。

這種方法的瓶頸是雜交和篩選的步驟。Schuldiner和Knop實驗室使用Singer Instruments公司的ROTOR來突破這些瓶頸。因此，用ROTOR處理菌株，雜交、產(chǎn)孢，標(biāo)簽交換篩選/計數(shù)篩選、被用來處理所有的應(yīng)變，交配和產(chǎn)孢程序，標(biāo)簽交換選擇/反選擇，以及在文庫中篩選成功的集成模塊。

這一迅速的過程意味著科學(xué)家可以在他們靈活地創(chuàng)建和可視化從未見過的蛋白質(zhì)。標(biāo)簽介導(dǎo)的定位問題已通過SWAp-TAG方法解決，因為它使ORFs可以在5'或3'末端進(jìn)行標(biāo)記，大幅地減少錯位或蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的影響。
 

“Creation of new libraries would not have been possible without our Singer ROTOR robot”.

——Prof. Maya Schuldiner – 2017

SWAT技術(shù)的應(yīng)用和意義

從理論上講，任何標(biāo)簽都可用于從N’-SWAT受體庫中構(gòu)建新的文庫。該標(biāo)簽可以用于共定位研究的不同顏色熒光，也可以是用于測量蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的互補(bǔ)標(biāo)簽。一旦生成了C’-SWAT受體文庫，無論是定量轉(zhuǎn)錄和翻譯效果的啟動子、UTR還是其他非編碼DNA，基因5’或3’末端的任何部分都可以被修改。半衰期可以用定時熒光來研究，或用下拉標(biāo)簽來分離蛋白質(zhì)。

SWAT法生成文庫，節(jié)省了很多寶貴的時間，使研究人員可以設(shè)計更多有意義的實驗，這也為系統(tǒng)探索細(xì)胞生物學(xué)的未知領(lǐng)域打開了一扇大門。Schuldiner實驗室已經(jīng)將N'SWAT文庫用于共定位篩選、過表達(dá)篩選以及體內(nèi)觀察相互作用。正如Schuldiner教授所說：“樂趣無窮！”。

ROTOR

合適的工具是實驗成功的關(guān)鍵